玻璃离子水门汀加入二氧化钛纳米颗粒后的机械与抑菌性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：玻璃离子水门汀已被逐渐应用于口腔临床的诸多方面，但其机械强度较低、抑菌作用不明显，限制了其进一步广泛应用。
目的：考察加入不同比例二氧化钛纳米颗粒对玻璃离子水门汀机械性能和抑菌作用的提升效果。
方法：实验分4组，低、中、高质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀中分别含3%，6%，9%二氧化钛纳米颗粒，对照组不含二氧化钛纳米颗粒。利用万能材料试验机和硬度测试仪考察各组试件的抗弯强度、抗压强度和表面硬度。将试样浸没在人工唾液中，采用氟离子选择性电极测定氟释放量累积量，利用直接接触法考察试样对变形链球菌的抑菌效果。
结果与结论：与对照组相比，低、中质量分数二氧化钛组高玻璃离子水门汀的抗弯强度、抗压强度和表面硬度显著提高(P < 0.05)，高质量分数二氧化钛组显著下降(P < 0.05)。各组玻璃离子水门汀的氟释放累积量随时间变化均表现为平滑递增曲线。低质量分数二氧化钛组变形链球菌的吸光度值最低。说明二氧化钛纳米颗粒的加入对玻璃离子水门汀的氟释放行为影响不显著，可显著提高对变形链球菌的抑菌效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 玻璃离子水门汀, 二氧化钛纳米颗粒, 抗弯强度, 抗压强度, 表面硬度, 氟释放累积量, 回归拟合方程, 变形链球菌

Abstract:

BACKGROUND: Glass ionomer cements have been gradually employed in many aspects of dental clinical field. However, low mechanical strength and antibacterial effect restrict its further applications.
OBJECTIVE: To proportionally explore the effects of titanium dioxide nanoparticles on the mechanical strength and antibacterial effect of traditional glass ionomer cements.
METHODS: Base on different mass fractions of titanium dioxide nanoparticles in glass ionomer cements, all the glass ionomer cement samples were divided into control group (no titanium dioxide nanoparticles), low titanium dioxide group (containing 3% titanium dioxide nanoparticles), medium titanium dioxide group (containing 6% titanium dioxide nanoparticles), and high titanium dioxide group (containing 9% titanium dioxide nanoparticles). A universal material testing machine and a hardness tester were used to examine flexural strength, compressive strength, and surface hardness of glass ionomer cement samples, respectively. Glass ionomer cement samples were immerged into the artificial saliva, and fluoride release was measured by using a fluoride ion selective electrode. The direct contact test was used to investigate antibacterial effect of glass ionomer cement samples towards Streptococcus mutans.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, few titanium dioxide nanoparticles (low and medium titanium dioxide group) could significantly improve flexural strength, compressive strength and surface hardness of glass ionomer cement samples (P < 0.05), and high titanium dioxide nanoparticles (high titanium dioxide group) significantly decreased flexural strength, compressive strength and surface hardness (P < 0.05). The introduction of titanium dioxide nanoparticles had little effect on fluorine release behavior of glass ionomer cement samples, and greatly improved antibacterial effect of glass ionomer cement samples towards Streptococcus mutans.

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Key words: glass ionomer, oral, mechanical strength, antibacterial effect

中图分类号:

R318

刘莉霞，陈琳. 玻璃离子水门汀加入二氧化钛纳米颗粒后的机械与抑菌性能[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4838-4844.

Liu Li-xia, Chen Lin . Effect of titanium dioxide nanoparticles on mechanical strength and bacterial inhibition of glass ionomer cements[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4838-4844.

图/表（结果） 3

2.1 各组玻璃离子水门汀试件的抗弯强度 图1显示对照组玻璃离子水门汀与低、中、高质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的抗弯强度。在不加入二氧化钛纳米颗粒时，对照组玻璃离子水门汀的抗弯强度仅为11.59×10⁶ Pa。少量二氧化钛纳米颗粒(3%)的加入即可显著提高Fuji II的抗弯强度，达到18.67×10⁶ Pa。当二氧化钛纳米颗粒含量继续增加时，Fuji II的抗弯强度逐渐下降，从6%二氧化钛纳米颗粒含量时的17.24×10⁶ Pa，迅速下降到9%二氧化钛纳米颗粒含量时的5.32×10⁶ Pa。除低质量分数二氧化钛组与加入6%二氧化钛纳米颗粒两组以外，其他的组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.2 各组玻璃离子水门汀试件的抗压强度 图2显示对照组与低、中、高质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的抗压强度，如图可知对照组玻璃离子水门汀的抗压强度随二氧化钛纳米颗粒的含量增加呈现先升高后降低的趋势。对照组玻璃离子水门汀的抗压强度由原始的65.04×10⁶ Pa，提高到低质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的89.35× 10⁶ Pa。对中质量分数二氧化钛组，玻璃离子水门汀抗压强度略微降至82.23×10⁶ Pa。当二氧化钛纳米颗粒含量进一步提高时(高质量分数二氧化钛组)，玻璃离子水门汀抗压强度显著下降，仅为46.77×10⁶ Pa。与抗弯强度的统计学分析结果类似，除低质量分数二氧化钛组与中质量分数二氧化钛组两组间以外，其他的组间两两比较差异均有显著的显著性意义(P < 0.05)。

2.3 各组玻璃离子水门汀试件的表面硬度 图3显示对照组与低、中、高质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的表面维氏硬度，如图可知少量二氧化钛纳米颗粒(3%)的加入对玻璃离子水门汀的表面硬度有一定的提升效果。对低质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀，其维氏硬度由对照组的38.92略微增加到42.35。中质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的维氏硬度与对照组相差不大，约为36.44。当二氧化钛纳米颗粒含量进一步提升时(高质量分数二氧化钛组)，玻璃离子水门汀的维氏硬度显著下降，仅为25.03。通过统计学分析发现，低质量分数二氧化钛组和高质量分数二氧化钛组与对照组的维氏硬度差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 对照组与低质量分数二氧化钛组的表面结构与内部微观形态 图4A，B显示对照组与低质量分数二氧化钛组通过SEM扫描电镜得到的的表面结构图。如图可知，与对照组相比，低质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀表面均匀性更好，表面更加光滑，同时具有更少的表面裂缝。图4C显示低质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的内部微观形态，如图可知二氧化钛纳米颗粒与玻璃离子水门汀原有成分结合紧密，二氧化钛纳米颗粒大多呈现球形并均匀分布在玻璃离子水门汀试件内部。

2.5 各组玻璃离子水门汀氟释放累积量的动态变化趋势与拟合分析 图5显示不同组别玻璃离子水门汀试件的氟释放累积量随时间变化趋势，如图可知各组玻璃离子水门汀的氟释放累积量随时间变化趋势均表现为平滑递增曲线，而氟释放累积量随二氧化钛纳米颗粒的含量升高而逐渐降低，在第28天时，对照组玻璃离子水门汀达到478.52 ng/mm²的氟释放累积量，随后依次为低质量分数二氧化钛组(449.87 ng/mm²)，中质量分数二氧化钛组(412.51 ng/mm²)和高质量分数二氧化钛组(364.17 ng/mm²)。采用拟合方程 Y=a+b*t^0.5+c* t对4组玻璃离子水门汀氟释放累积量进行非线性回归分析。表1显示拟合方程的重要参数值和相关系数R2。如表可知，该方程可较好模拟各组玻璃离子水门汀试件的氟释放过程，对对照组、低质量分数二氧化钛组和中质量分数二氧化钛组的相关系数均为0.999，高质量分数二氧化钛组也达到了0.996。

2.6 各组玻璃离子水门汀试件对变形链球菌的抗菌性能 图6显示不同组别玻璃离子水门汀试件影响下变形链球菌的吸光度随时间变化趋势。如图可知，对空白和对照组玻璃离子水门汀试样，变形链球菌呈现一个较快的生长速度，在第24小时时，吸光度分别达到了1.36和1.30，未表现出抑菌效果。而对各实验组玻璃离子水门汀试样而言，少量比例二氧化钛纳米颗粒的加入即可产生明显的抑菌效果，对低质量分数二氧化钛组，在第24小时时，吸光度仅为0.10。当二氧化钛纳米颗粒含量继续增加时，玻璃离子水门汀试样的抑菌效果略有提升，对中质量分数二氧化钛组和高质量分数二氧化钛组，第24小时时的吸光度分别为0.06和0.03。

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引言

玻璃离子水门汀(glass ionomer cement，GIC)具有较高的氟释放能力，良好的黏结性和生物相容性、较小的牙体刺激性、较低的细胞毒性，被广泛应用于牙体缺损修复、窝沟封闭、垫底、黏结等牙科临床的诸多方面^[1-4]。但另一方面，玻璃离子水门汀存在耐磨性差、脆性大、抗压强度低等缺陷，尤其是较低的断裂韧性，使之难以承受后牙区作用力，因此仅能作为压力较小的前牙区的充填材料，严重限制了玻璃离子水门汀的进一步广泛应用^[5-8]。近年来，树脂、金属、羟基磷灰石等各种改良剂被加入到玻璃离子水门汀中以提高玻璃离子水门汀的机械性能、耐磨性和美观性^[9-10]。在各种改良剂中，纳米材料由于其独特性质而成为国内外实验者的实验热点^[11-13]。Moshaverinia等^[14]将羟基磷灰石和氟磷灰石纳米生物陶瓷加入到传统的玻璃离子水门汀中，加强了玻璃离子水门汀的机械强度及与牙本质的黏结强度。另一项实验中，加入了氟化镱和硫酸钡纳米颗粒的玻璃离子水门汀显著提高了玻璃离子水门汀的24 h抗压强度和表面硬度^[15]。在各种纳米材料中，二氧化钛(TiO₂)纳米颗粒具有化学稳定性高、生物兼容性好、无毒性等优良特性^[16]。更重要的是，二氧化钛纳米颗粒可产生具有较强杀菌作用的羟基自由基，若能加入至玻璃离子水门汀中，可使玻璃离子水门汀通过释放氟而实现的被动抑菌变为通过羟基自由基实现主动杀菌。目前在口腔领域，二氧化钛纳米颗粒主要作为口腔树脂材料和环氧树脂的补强填充剂^[17-18]，而作为玻璃离子水门汀改良剂的相关实验还未见报道。

因此，实验考察了添加不同比例二氧化钛纳米颗粒对玻璃离子水门汀机械强度(抗弯强度、抗压强度和表面硬度)、氟释放特性和抑菌作用(对变形链球菌)的提升效果实验，拟为玻璃离子水门汀机械强度和抑菌作用的相关实验提供重要参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体外检测实验。

时间及地点：于2013年5月至2014年2月在深圳市第二人民医院医院口腔内科实验室完成。

材料：采用日本而至公司生产的Fuji II传统型玻璃离子水门汀，其粉剂为钙氟铝硅酸盐玻璃粉，液剂为聚丙烯酸溶液。二氧化钛纳米颗粒购于德国Sigma-Aldrich公司，颗粒粒径约为21 nm。

实验方法：

分组：基于前期预实验情况确定了玻璃离子水门汀中加入二氧化钛纳米颗粒的质量分数，通过兼顾玻璃离子水门汀的固有性质与二氧化钛纳米颗粒的强化作用，实验分4组，对照组(不含二氧化钛纳米颗粒)、低质量分数二氧化钛组(含3%二氧化钛纳米颗粒)、中质量分数二氧化钛组(含6%二氧化钛纳米颗粒)和高质量分数二氧化钛组(含9%二氧化钛纳米颗粒)。

玻璃离子水门汀试件的制备：对照组玻璃离子水门汀的制备过程按照生产厂家的使用说明与前人实验成果制作^[19]，低、中、高质量分数二氧化钛组玻璃离子水门汀的调和过程中分别加入占粉剂3%，6%和9%质量分数的二氧化钛纳米颗粒。利用不锈钢片制成不同大小、形状的模具，在模具内部充填好玻璃离子水门汀后两端盖上塑料薄膜并用玻璃板压平，置于相对湿度95%，37 ℃恒温箱中24 h，之后取下塑料薄膜修整成玻璃离子水门汀试样。

抗弯强度测试：制作25.0 mm×5.0 mm×2.5 mm的玻璃离子水门汀试件20个，每种5个。将试件水平放置在万能材料试验机的加载台上，使压头中心和试件中心成一条直线，开启加载程序对试件进行垂直加压，进行3点加载方式直至试件断裂，加载速度为0.5 mm/min，记录试件所受到的最大压力值。试件的弯曲强度σ=3PL/2BD2，其中P为试件所受到的最大压力，L为下加载台两加载点的距离 10 mm，B为试件的宽度，D为试件的厚度。

抗压强度测试：制作20个25.0 mm×5.0 mm×2.5 mm的玻璃离子水门汀试样，每种5个。抗压强度测试在万能材料试验机上进行。加载速度为1 mm/min，在玻璃离子水门汀试件受力断裂瞬间记录试件所受的压力。试件的抗压强度Cs=F/(W•H)，其中F为试件断裂时所受的力，W，H分别为试件的宽和厚。

表面硬度测试：制作直径6 mm，厚度3 mm的玻璃离子水门汀试件20个，每种5个。利用数字式硬度测试仪测量各个试件的表面硬度，试件的维氏硬度VHN=1.854 4L/D2，其中，L为仪器施加的载荷，D为通过仪器测量出的形成压痕的对角线长度。

扫描电镜检测：取对照组玻璃离子水门汀试样与含3%纳米颗粒玻璃离子水门汀试样在常温下用低速切片机进行切片，采用不同目数砂纸打磨后，用导电胶粘在细铜片上进行离子溅射仪真空镀膜，采用扫描电镜进行玻璃离子水门汀内部形态的显微观测。

氟释放量的测定：根据前人对氟释放量的测定方法^[20-21]，制作直径6 mm，厚度3 mm的玻璃离子水门汀试件20个，每种5个。将各玻璃离子水门汀试件分别浸泡在5 mL人工唾液中，置于37 ℃恒温箱中28 d，每日更换5 mL新鲜的人工唾液，用氟离子选择电极测定更换下来溶液的氟离子浓度。每次氟离子选择性电极测得的平衡电位用标准曲线换算成氟离子质量浓度(mg/L)。进一步换算为氟释放量(ng/mm²)，将各时间点测得的氟释放量与之前的测量值相加得到氟离子累积释放量(ng/mm²)。

抗菌性能测试：玻璃离子水门汀试件的抗菌性能采用Weiss等的直接接触方法进行测定^[22]，即为检测细菌在96孔微孔板内生长而导致的浊度变化。具体在96孔微孔板各个微孔边壁分别放置对照组玻璃离子水门汀材料和含不同二氧化钛纳米颗粒含量的玻璃离子水门汀材料，空白组为未加入玻璃离子水门汀材料的微孔。在每个微孔内加入10 μL含10⁶个变形链球菌的菌液和240 μL脑心浸出液肉汤培养基，利用分光光度计测量不同时间在600 nm波长下的吸光度变化。

主要观察指标：各组抗弯强度，抗压强度，表面硬度，微观形态，氟释放累积量，变形链球菌吸光度。

统计学与拟合分析：采用回归方程Y=a+b*t^0.5+c*t对各种玻璃离子水门汀氟释放累积量与时间的关系进行拟合，其中，Y为玻璃离子水门汀氟释放累积量，t是浸入时间，a，b，c为参数。数据用x(_)±s表示，用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析和Tukey多重比较检验^[9]，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验发现向玻璃离子水门汀中加入质量分数3%和6%的二氧化钛纳米颗粒可显著提高玻璃离子水门汀的抗弯强度，加入9%的二氧化钛纳米颗粒后抗弯能力显著下降，这可能归因于二氧化钛纳米颗粒与玻璃离子水门汀中玻璃颗粒的相互作用。当二氧化钛纳米颗粒含量相对较少时，尺寸微小的二氧化钛纳米颗粒可以作为玻璃离子水门汀中固体玻璃粉末的良好补充，其一方面可以填充玻璃离子水门汀玻璃粉末颗粒间存在的空位，另一方面可以作为额外的聚丙烯酸聚合物连接位点以加强玻璃离子水门汀的抗弯强度^[22]。此外，二氧化钛纳米颗粒的加入使玻璃离子水门汀中的固体玻璃粉末与纳米颗粒形成一个较宽的粒径分布，通过增大玻璃离子水门汀的致密程度而提高玻璃离子水门汀的抗弯强度。当二氧化钛纳米颗粒含量继续增加时，玻璃离子水门汀的抗弯强度显著下降，甚至低于对照，这可能归因于与玻璃粉末相比，二氧化钛纳米颗粒具有较小的颗粒尺寸和较大的表面积，导致在玻璃离子水门汀的聚合过程中聚丙烯酸的数量不足以有效聚合较大数量的二氧化钛纳米颗粒，从而弱化了玻璃离子水门汀中固体颗粒与聚合物之间的界面结合作用^[23]。

当玻璃离子水门汀中加入质量分数3%和6%的二氧化钛纳米颗粒时，抗压强度与表面硬度显著提升，加入质量分数9%二氧化钛纳米颗粒时抗压强度和表面硬度显著下降，这可能归因于二氧化钛纳米颗粒与聚合物之间的界面反应作用。对抗压强度，较高含量的二氧化钛纳米颗粒会对正常的玻璃离子水门汀固化反应产生明显干扰，而纳米颗粒之间缺乏直接交联作用，从而使玻璃离子水门汀的抗压效果变弱。对表面硬度，较低含量二氧化钛纳米颗粒对玻璃离子水门汀表面硬度的提升作用可能归因于颗粒与聚合物的界面反应过程。当加入二氧化钛纳米颗粒后，玻璃离子水门汀表面的玻璃粉末颗粒含量变少，致使更多数量的丙烯酸与纳米颗粒反应。由于纳米颗粒的空隙填充效果，因此二氧化钛纳米颗粒在表面的比例较高，通过二氧化钛的较高硬度提高了玻璃离子水门汀的表面硬度^[24]。二氧化钛纳米颗粒含量进一步升高时玻璃离子水门汀表面硬度的下降可能同样归结于大量二氧化钛纳米颗粒对玻璃离子水门汀整体结构的弱化^[25]。

对玻璃离子水门汀的氟释放行为，加入质量分数3%，6%和9%二氧化钛纳米颗粒玻璃离子水门汀与对照组玻璃离子水门汀的氟释放行为较为类似，回归方程Y=a+b*t^0.5 +c*t可以较好反映各组玻璃离子水门汀的氟释放行为规律。在该方程的3个参数中，a 即为表面溶解量，是与时间无关的玻璃离子水门汀固化体表面物质溶出系数，b 是扩散系数 c为其崩解系数。与对照组玻璃离子水门汀相比，加入二氧化钛纳米颗粒玻璃离子水门汀的表面溶解行为、扩散与崩解行为略微下降，且随着二氧化钛纳米颗粒含量的升高而降低。但从总体上看，二氧化钛纳米颗粒的加入未对玻璃离子水门汀氟释放行为产生明显影响。加入二氧化钛纳米颗粒玻璃离子水门汀的氟释放行为亦可以通过目前的理论进行解释，如Chan等^[26]认为当玻璃离子水门汀与溶液接触时，表面会发生酸性化学反应，使氟离子从表层聚合盐基质中大量释放。Verbeeck等^[27]认为玻璃离子水门汀氟离子释放模式存在两个阶段，第一阶段是初期表面大量氟离子释放，之后显著减少，在第二阶段，少量氟离子从内部长期缓慢地扩散到周围溶液。Mousavinasab等^[28]认为玻璃离子水门汀的氟释放过程存在两个机制，首先是玻璃离子水门汀表面层的大量溶解，这个过程主要发生在第1天，此时会释放大量的氟离子；之后是玻璃离子水门汀内部氟离子的迁移作用，这个过程相对缓慢但氟释放量较为稳定。

当考察二氧化钛纳米颗粒对玻璃离子水门汀的抑菌提升效果时发现，对照组玻璃离子水门汀未对变形链球菌产生良好的抑菌效果，这与Vermeersch等^[29]的实验相一致，而加入质量分数3%，6%和9%二氧化钛纳米颗粒在抑制变形链球菌生长方面均显示出较好效果。变形链球菌是一种重要的口腔致龋菌，实验发现，少量二氧化钛纳米颗粒的加入即可实现对变形链球菌的良好抑制作用，前人实验表明：由于二氧化钛电子结构所具有的特点，使其可生成化学活泼性很强的超氧化物阴离子自由基和羟基自由基，当遇到细菌时可直接攻击细菌的细胞，致使细菌细胞内的有机物降解，以此杀灭细菌并使之分解^[30]。

同时，二氧化钛纳米颗粒能破坏细菌的细胞膜结构，达到彻底降解细菌，防止内毒素二次污染的目的^[31-45]。说明加入的较小尺寸二氧化钛纳米颗粒产生了迅速的细菌胞内损伤效果，从而实现了对玻璃离子水门汀抑菌效果的显著提升作用。综上所述，实验通过将少量二氧化钛纳米颗粒加入至玻璃离子水门汀中，在不影响玻璃离子水门汀氟释放行为的前提下，实现了玻璃离子水门汀机械性能和抑菌效果的复合提升作用。

当综合考虑二氧化钛纳米颗粒对玻璃离子水门汀机械性能与抑菌效果的提升作用时，质量分数3%的二氧化钛纳米颗粒为较适当的投加比例。与更高的投加比例(6%和9%)相比，该投加比例下的玻璃离子水门汀显示出最高的抗弯强度和表面硬度，以及相对较高的抗压强度。此外，在该投加比例下，玻璃离子水门汀的氟释放行为未受明显影响，同时显示出较好的变形链球菌抑菌效果。综上所述，向玻璃离子水门汀中投加少量二氧化钛纳米颗粒，可实现机械性能与抑菌作用的综合提升效果，促进玻璃离子水门汀在口腔临床领域的更广泛应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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